令和６年１月１４日公開

ウイルス学において病原ウイルスを「分離」する理由は、「単離」の代用をしたいからである。つまり、単離できない代わりに、分離で以て、病原ウイルスの存在を証明したいのである。だから、「培養細胞の死滅の確認」を「分離」と呼ぶ無茶なことをしているのであって、これが「単離」を意味しているとの強い思いがウイルス学者の胸の内にあるのである。でなければ、「分離」と呼ばないだろう。

したがって、病原ウイルスの存在を示すためには、ともかく培養細胞には死んでもらわないと困るわけだ。そういう訳で、簡単に死んでくれる培養細胞を開発することは、ウイルス学者にとって重要課題であると言える。

エンダース論文の説明でも述べたが、「サルの腎臓は、ウイルスの接種後に上記のような特徴的な変化が確実に観察される細胞の成長をもたらした唯一の組織である。」とエンダース博士が述べているように、サルの腎臓細胞はよく死んでくれる、ウイルス学者にとって有難い細胞である。

そのサルの腎臓細胞の中でも、Vero細胞が有名である。

ここでは、Vero細胞について軽く紹介し、他の細胞に比べてどれだけ死ぬことに関して優秀なのかをお話ししたい。

感染研のサイトに「Vero細胞の物語」という記事がある。

この記事では以下のような記述がある。

1950年代はポリオワクチンの開発が成功した時代でもありました。HeLa細胞もポリオの研究に使用されましたが、ワクチンのもととなるポリオウイルスの生産にはサルから摘出した腎臓組織の一次培養細胞primary culture cellsが当時は使用されていました。準備できる細胞の量とウイルス増殖の面からサル腎臓が有利だったのです。何故、サルの腎臓細胞でウイルスが比較的よく増えるのかそのメカニズムは今でも未解明です。

「ウイルス増殖」とは「培養細胞の死滅」を意味するから、そう読み替えると、感染研の記事でも、サルの腎臓細胞がよく死んでくれると書かれていることが分かる。その次の文章で、サルの腎臓細胞がなぜよく死んでくれるのか、そのメカニズムは今でも未解明と書かれているのが、細胞を殺しまくっている罪の意識が感じられず、非常に奥ゆかしく感じる。

更に次のようなことも書かれている。

スペラント語（世界共通言語として開発された言語であったが今や廃れてしまった感がある）をよくした安村先生は、アフリカミドリザルの腎臓から由来するこの新しい細胞株にエスペラント語で「緑の腎臓」を意味する“Verda Reno”を縮めてVeroという名を与えました。さらに、Veroというスペルがエスペラント語で「真実」（ラテン語ならVeritas）を意味するという卓越したネーミングとなっています（余談１）。

Vero細胞を使ってウイルス学者は病原ウイルスが存在すると騙しているわけだが、その「Vero」が「真実」を意味すると、安村先生という方が鼻高々でこのネーミングに酔っているのだとしたら、「真実」の意味でさえ、ウイルス学では別の意味、例えば「嘘をつき続けること」、ではないだろうかと勘繰ってしまう。

冒頭に述べたようにVero細胞は感染症関連の研究や検査、そしてワクチン生産と幅広い役割をこの半世紀ずっと人類に対して果たしてきました。本HP原稿を記している2015年の現在、日本で流通しているヒト用ワクチンで、日本脳炎、ロタ、ポリオに対するワクチンはVero細胞を生産細胞に用いています。まだワクチンがないウイルス感染症に関してもVero細胞を利用しながら開発しようとしているものが複数あるようです[7, 8]。

この記述はワクチンを理解する上で重要である。培養細胞が死滅すると、細胞の破片が出てきたり、内部から細胞外小胞などの粒子が出てきたりして、病原ウイルスの設定の大きさのゴミが大量にできる。その大量のゴミの産出を、ウイルス学者は病原ウイルスが増殖したと呼んでいるのだが、これをそのままワクチンとして使用している。このようなゴミがヒトの血管に直接入って、健康によい訳がなく、これらのゴミが分解されるときに副産物として生成される毒性物質ができてしまうと、ヒトは大きなダメージを受けてしまう。これは、中世ヨーロッパの戦争で、ヒトの死体を相手国の川に入れて、死体が分解されたときにできる毒で相手国の環境を汚染させることが行われていたが、発想としては同じである。ただし、培養細胞のゴミの分解では期待している効果（毒性）が得られないので、アジュバントと呼ばれる毒を追加している。

このVero細胞の物語では、冒頭に感染研が発表した論文が紹介されている。

私たちは、最近、Vero細胞の全ゲノム配列を決定しました[1](オープンアクセス雑誌に上梓した論文ですのでリンクしました）。

このリンク先で、以下の論文を読むことができる。

• NAOKI Osada et al.：「The Genome Landscape of the African Green Monkey Kidney-Derived Vero Cell Line（アフリカミドリザル腎臓由来Vero細胞株のゲノムの概観）」，DNA RESEARCH 21, 673–683, (2014)

この論文では、以下のようなことが書かれている。

Vero cells were found to be highly susceptible to various types of viruses including simian polyoma virus SV-40,^1,2 measles virus,³ rubella virus,^4,5 arboviruses,^6,7 and adenoviruses⁷ soon after their establishment, and were later found to be also susceptible to bacterial toxins including the diphtheria toxin,⁸ heat-labile enterotoxins,⁹ and Shiga-like toxins (or ‘Vero’ toxins).^10,11 After their global distribution,^12,13 the application range of Vero cells extended from virology in academic laboratories to diagnostic practices in hospitals and bacterial toxin assays.

（邦訳）

Vero細胞は、確立後まもなく、類人猿ポリオーマウイルスSV-40、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、アーボウイルス、アデノウイルスなどの各種ウイルスに高い感受性を示し、その後、ジフテリア毒素、熱傷性腸毒素、志賀毒素などの細菌毒素（またはVero毒素）にも感受性があることが明らかにされた。その後、Vero細胞は世界的に流通し、その応用範囲は学術研究所のウイルス学から病院での診断、細菌毒素の測定にまで広がっていった。

この文章から分かるように、Vero細胞は毒素に対して高い感受性を持ち、よく死んでくれることが分かる。したがって、抗生物質を多く与えると死滅するというトリックが可能なのである。

他にもVero細胞に関して興味深い論文がある。

• Jennifer Harcourt et al.：「Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Patient with Coronavirus Disease, United States（米国におけるコロナウイルス疾患患者からの重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型）」，Emerging Infectious Diseases, Vol. 26, No. 6, June 2020.

この論文の面白いところは、同じ検体に対して様々な培養細胞を用いて分離していることである。それによって、培養細胞の死にやすさを比較することができるのである。

Cell Culture, Limiting Dilution, and Virus Isolation

We used Vero CCL-81 cells for isolation and initial passage. We cultured Vero E6, Vero CCL-81, HUH 7.0, 293T, A549, and EFKB3 cells in Dulbecco minimal essential medium (DMEM) supplemented with heat-inactivated fetal bovine serum (5% or 10%) and antibiotics/antimycotics (GIBCO, https://www.thermofisher.comExternal Link). We used both NP and OP swab specimens for virus isolation. For isolation, limiting dilution, and passage 1 of the virus, we pipetted 50 μL of serum-free DMEM into columns 2–12 of a 96-well tissue culture plate, then pipetted 100 μL of clinical specimens into column 1 and serially diluted 2-fold across the plate. We then trypsinized and resuspended Vero cells in DMEM containing 10% fetal bovine serum, 2× penicillin/streptomycin, 2× antibiotics/antimycotics, and 2× amphotericin B at a concentration of 2.5 × 105 cells/mL. We added 100 μL of cell suspension directly to the clinical specimen dilutions and mixed gently by pipetting. We then grew the inoculated cultures in a humidified 37°C incubator in an atmosphere of 5% CO2 and observed for cytopathic effects (CPEs) daily. We used standard plaque assays for SARS-CoV-2, which were based on SARS-CoV and Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) protocols (9,10).

When CPEs were observed, we scraped cell monolayers with the back of a pipette tip. We used 50 μL of viral lysate for total nucleic acid extraction for confirmatory testing and sequencing. We also used 50 μL of virus lysate to inoculate a well of a 90% confluent 24-well plate.

（邦訳）

細胞培養、限界希釈、ウイルスの分離

分離と初期継代には Vero CCL-81 細胞を使用した。Vero E6、Vero CCL-81、HUH 7.0、293T、A549、およびEFK3B細胞を、熱不活性化牛胎児血清（5%または10%）と抗生物質/抗真菌剤（GIBCO、https://www.thermofisher.com）添加のDulbecco minimal essential medium（DMEM）中で培養した。ウイルス分離には、NP（鼻咽頭）とOP（口腔咽頭）の両方のスワブ（綿棒）検体を使用した。ウイルスの分離、限界希釈、継代1のために、96ウェル組織培養プレートのカラム2〜12に無血清DMEMを50μLずつピペッティングし、カラム1に臨床検体を100μLずつピペッティングしてプレート全体で2倍連続希釈を行った。次に、10%牛胎児血清、2×ペニシリン/ストレプトマイシン、2×抗生物質/抗菌薬、2×アンフォテリシンBを含むDMEMに、Vero細胞をトリプシン処理して2.5×105 cells/mLの濃度で再懸濁した。細胞懸濁液100μLを臨床検体希釈液に直接添加し，ピペッティングにより穏やかに混合した。その後，接種した培養液を5％CO2雰囲気の加湿37℃インキュベーターで培養し，毎日細胞変性効果（CPE）を観察した。SARS-CoV-2のプラークアッセイは、SARS-CoVおよび中東呼吸器症候群コロナウイルス（MERS-CoV）のプロトコルに基づいた標準的なものを使用した。

CPEが観察された場合、ピペットチップの背で細胞単層膜を掻き取りました。50μLのウイルス溶解液を、確認試験およびシークエンス用の全核酸抽出に使用した。また、90%コンフルエント24ウェルプレートの1ウェルへの接種には、50μLのウイルス溶解液を使用した。

ここで使用されている培養細胞は、Vero E6（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞）、Vero CCL-81（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞）、HUH 7.0（高分化型ヒト肝癌由来細胞株）、293T（ヒト胎児腎細胞）、A549（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）、およびEFK3B（コウモリ上皮褐色腎臓細胞株）である。

分離方法を見ると、細胞培養時と検体接種時で、血清の濃度は変えていないが、抗生物質が２倍になっている。このことから、この論文では抗生物質によって細胞変性効果を起こすことを狙っていることが分かる。

細胞変性効果が見られた結果について、次のような記載がある。

Because research has been initiated to study and respond to SARS-CoV-2, information about cell lines and types susceptible to infection is needed. Therefore, we examined the capacity of SARS-CoV-2 to infect and replicate in several common primate and human cell lines, including human adenocarcinoma cells (A549), human liver cells (HUH7.0), and human embryonic kidney cells (HEK-293T), in addition to Vero E6 and Vero CCL81 cells. We also examined an available big brown bat kidney cell line (EFK3B) for SARS-CoV-2 replication capacity. Each cell line was inoculated at high multiplicity of infection and examined 24 h postinfection (Figure 3, panel A). No CPE was observed in any of the cell lines except in Vero cells, which grew to >10⁷ PFU at 24 h postinfection. In contrast, HUH7.0 and 293T cells showed only modest viral replication, and A549 cells were incompatible with SARS-CoV-2 infection. These results are consistent with previous susceptibility findings for SARS-CoV and suggest other common culture systems, including MDCK, HeLa, HEP-2, MRC-5 cells, and embryonated eggs, are unlikely to support SARS-CoV-2 replication (20–22). In addition, SARS-CoV-2 did not replicate in bat EFK3B cells, which are susceptible to MERS-CoV. Together, the results indicate that SARS-CoV-2 maintains a similar profile to SARS-CoV in terms of susceptible cell lines.

（邦訳）

SARS-CoV-2に対する研究や対応が始まっているため、感染しやすい細胞株や種類についての情報が必要である。そこで、SARS-CoV-2が、Vero E6細胞、Vero CCL81細胞に加え、ヒト腺癌細胞（A549）、ヒト肝細胞（HUH7.0）、ヒト胚性腎細胞（HEK-293T）など、一般的な霊長類およびヒト細胞株に感染し複製する能力を検討した。また、入手可能なオオコウモリの腎臓細胞株（EFK3B）についてもSARS-CoV-2の複製能を検討した。各細胞株を高倍率で接種し、感染後24時間経過した時点で調べた（図3、パネルA）。感染後24時間で>107PFUに増殖したVero細胞を除き、いずれの細胞株でも細胞変性効果は観察されなかった。一方、HUH7.0と293T細胞は適度なウイルス複製しか認めず、A549細胞はSARS-CoV-2感染に不適合であった。これらの結果は、これまでのSARS-CoVの感受性に関する知見と一致しており、MDCK、HeLa、HEP-2、MRC-5細胞、胚珠など他の一般的な培養系はSARS-CoV-2の複製を支持しない可能性があることが示唆された。さらに、SARS-CoV-2は、MERS-CoVに感受性のあるコウモリEFK3B細胞では複製されないことがわかった。これらの結果から、SARS-CoV-2は感受性細胞株という点でSARS-CoVと同様のプロファイルを維持していることが示された。

この論文によるとVero細胞以外は細胞変性効果が見られなかったことが分かる。分かりやすく言うと、Vero細胞は２倍の抗生物質で死ぬが、他の細胞は２倍では足りなかったということである。それだけ、Vero細胞は他の細胞に比べてよく死んでくれることが分かる。

さて、この結果が何を意味するのかということだが、Vero細胞はわずかな変化でよく死んでくれるため、トリックがバレ難いということである。つまり、手品でいうと、培養細胞の培養時は、シルクハットの中身を見せて「タネも仕掛けもございません。」と観客に伝えている場面を意味し、検体の接種時はシルクハットに布をかぶせる場面を意味する。そのトリックを行う時に、大袈裟な動作であればすぐに観客に見抜かれてしまうだろう。だから、手品師はわずかな動きで素早くトリックを行う。それと同じで、血清濃度や抗生物質の量を大きく変えれば、なぜそんなに変えなければならないのだ？と指摘されやすくなる。わずかな変化であれば、気づかれにくいということである。

ところで、この結果の面白さはそれだけではない。疫学的にこの結果を見たとき、新型コロナウイルスは、サルの細胞に対しては感染力があるが、ヒトやコウモリには感染力がないということが示されてしまったということである。さらに、SARSのこれまでの知見と一致するとも書かれている。つまり、あれだけ騒いでおきながら、実験ではヒト細胞に対しては感染力がないことが分かっていたということである。また、新型コロナウイルスはコウモリ由来であったはずだが、コウモリの細胞にも感染力がないことが示されている。こうした矛盾した実験結果に、ウイルス学者はどう説明するのか。なぜこのような似非科学を他の学問のエキスパートは指摘もせず、放置しているのか。学問とは何なのか、科学とは何なのか、呆れて空を見上げてしまうのは、私だけだろうか。

他の細胞に比べてよく死んでくれるVero細胞であるが、手品師がトリックを見抜かれないために日々研究を重ねているのと同じようにVero細胞の研究も進んでいる。

東京都健康安全研究センターでは、次のような論文を発表している。

• 吉田勲 et al.：「東京都において分離された Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) オミクロン変異株の分離培養条 件の検討」 , 東京健安研セ年報 Ann. Rep. Tokyo Metr. Inst. Pub. Health, 73, 39-44, 2022.

まず、アブストラクトの部分を以下に引用する。

我々は，新型コロナウイルス感染症（COVID-19）発生時初期からVero系細胞を用いて，原因ウイルスであるSevere acute respiratory syndrome coronavirus 2（SARS-CoV-2）の分離培養を行ってきたが，オミクロン変異株は，従来の株（アルファ株，デルタ株等含む）とは異なり，分離培養しにくい事例も見られている．今回VeroE6, Vero細胞へのアンフォテリシンB添加の効果について検討し，分離率の向上を図った．その結果VeroE6,Vero細胞はアンフォテリシンB添加維持培地を使用することで，分離率が向上した．今後も登場するであろう，新たなSARS-CoV-2の変異株について，分離培養条件についても引き続き検討を続けていく必要があると考える．

この研究の動機は、分離培養しても細胞変性効果が見られない事例が起きていることにあるようだ。そして、培養細胞がよりよく死んでくれるために検討した結果、アンフォテリシンBを添加することを考えたらしい。

ここで興味深いのは、疫学的に考えたとき、「分離培養が成功しない」が意味するところは、「感染力が低い」であるはずなのに、ウイルス学者達はそう考えないということである。そもそも分離は単離できないことに対する、存在証明の代替方法であったから、ウイルス学者にとっては「分離培養が成功しない」は「存在を証明できない」を意味していることが、よく分かる事例である。

更にこの論文の結論部分を以下に引用する。

2021 年 12 月下旬より 2022 年 5 月 20 日までに供試された臨床試験検体 151 件を用いて SARS-CoV-2 の分離培養を行ったところ，オミクロン株 58 件（38.4%），デルタ株 13 件（8.6%），型別不能株 1 件（0.7%），計 72 件が分離された．分離されたオミクロン株を細胞別に見るとアンフォテリシン B を添加した MM を用いた Vero E6 細胞では，45 件中 36 件（80.0%），Vero 細胞では 39 件中21 件（53.8%）であった．アンフォテリシン B を添加した MM により Vero E6 細胞，及び Vero 細胞で明らかな分離率の向上が見られた．その一方で，Vero E6 細胞とVero E6/TMPRSS2 細 胞 で 分 離 さ れ た も の が 23 株（39.7%） ，Vero E6/TMPRSS2 細胞 20 株 （34.5%）であり，これらを合わせると 58 件中 43 件（74.2%）とオミクロン株においても TMPRSS2 が細胞への感染に利用されていることも示唆された．以上のことから，オミクロン株の分離培養には，アンフォテリシン B 添加 MM を使用した Vero E6 細胞及び Vero E6/TMPRSS2 細胞を用いることでより効率的に分離培養を行うことができると考えられた．

この論文では、アンフォテリシンB添加MMを使用したVero細胞を使うと、さらによりよく死んでくれることが分かったようだ。このように、ウイルス学者は存在証明をするために、何が何でも細胞によりよく死んでもらえるよう日々努力をしていることが分かる。なんだか、テストの点数が悪かったら、勉強するのではなく、もっと簡単なテストを用意するような努力である。

ウイルス学者が病原ウイルスの存在証明をするために行ってきた「分離」において、確実に死んでくれる培養細胞であるVero細胞について紹介した。仮に病原ウイルスが存在するとして、培養試験が意味するところは「感染力」の程度を知ることであるだろうし、そうであればよりよく死んでくれる細胞を使用するのではなく、ヒト細胞を使用するべきである。特に新型コロナウイルスの感染力を知りたければ、ヒトの肺細胞を使用するべきだ。しかし、Vero細胞に関する研究を見る限り、ウイルス学者はよりよく死んでくれる細胞を求めていることが分かる。それはウイルス学者の関心が、存在しない病原ウイルスの特徴を科学的に解析することよりも、専ら手品の成功にあることの表れであることが言えるだろう。