2019 年に中国で発生した新型重症急性呼吸器症候群（SARS）様肺炎症候群パンデミック（1,2）の原因ウイルスである SARS コロナウイルス 2（SARS-CoV-2）が発見されて以来、電子顕微鏡像が医学文献（2）やメディアを賑わせており、特徴的な 60～140nm の丸い粒子が 9～12nm の特徴的なスパイクの「コロナ」に囲まれている様子が確認されている（2）。これらの画像の多くは、培養細胞に SARS-CoV-2 を「in vitro」で感染させた後に得られたものであり(2)、ウイルス粒子を忠実に再現していると考えられるが、我々は、コロナウイルス感染症 2019(COVID-19)が陰性の患者と COVID-19 以前の時代の腎生検の両方で、ポドサイトや尿細管上皮細胞内に形態学的に区別できない封入体を観察している。近位尿細管上皮(3)やポドサイト(4)にアンジオテンシン変換酵素 2（SARS-CoV-2 が細胞にアクセスするための受容体）が存在することから、腎臓への直接感染は理論的には可能であるが、COVID-19 患者の尿サンプルからはリアルタイム RT-PCR でウイルスは検出されていない（5-7）。また、ウイルスが腎実質に到達するためには、ウイルス血症が発生する必要があるが、これは少数の患者でしか検出されていない（6-8）。

したがって、COVID-19 患者の生検や剖検材料から得られた組織の電子顕微鏡像を用いて、形態のみからウイルスによる組織感染を推測することには注意が必要であると考えられる。さらに、免疫組織化学的な結果を解釈する際には、特に近位尿細管内では、その強い再吸収能力のために様々な抗体による非特異的な染色が起こりやすいので注意が必要である。さらに、これらの症例で組織感染を確実に確認するためには、特異的なウイルス抗原を用いた免疫電子顕微鏡検査(9)やウイルス RNA の in situ ハイブリダイゼーションなど、より特異的な技術が必要であると考えられる。

実際、COVID-19 患者の崩壊性糸球体障害に関する最近の 2 つの報告では、in situ ハイブリダイゼーションに
よって腎臓にウイルス RNA が検出されなかった(10,11)。さらに，COVID-19 患者の腎臓で陽性染色を示すことが知られている SARS-CoV-2 核タンパク質抗体を用いた免疫組織化学的分析では，当研究室のすべての腎臓の腎実質に非特異的な陽性染色が認められた(10)．

我々は、超微細構造的に SARS-CoV-2 ウイルスと形態的に区別できない内因性ミミッカーが存在する
のではないかと推測した。これを確認するために，電子顕微鏡で症例を観察し，ポドサイト，尿細管上
皮細胞，内皮細胞に，直径 60～140 nm の丸い細胞質封入体が，単独または集団で存在していることを
確認した．この研究は，Solutions Institutional Review Board の承認を得ており，ヘルシンキ宣言で強
調されている倫理原則に従った。超微細構造の形態を最適化するために，迅速に処理された症例は除外
し，腎生検組織がルーチン処理（一晩の重合と標準的なグリッド染色を含む）された症例のみをレビュ
ーした。5 例は COVID-19 以前の時代のもので、10 例は最近のものであった（生検日は 2020 年 2 月か
ら 4 月）。8 例は同種移植で、6 例は生来の腎生検であった。症例の詳細は表 1 に記載されている。ウイ
ルス様封入物は、直径 50～139nm の単一の小胞と、より大きな小胞内のパックされたグループの両方
からなるもので、15 例すべてにおいて、ポドサイト、尿細管上皮、または血管内皮細胞のいずれかに見られた（図 1）。

表１  生検の特徴（日付、適応症、簡単な臨床歴、最終診断など）

• N、生来の腎臓； Cr、クレアチニン（すべての値は  mg/dl  単位、基準範囲は  0.6  ～  1.3 mg/dl）； F、女性；DM2、2型糖尿病；CHF、うっ血性心不全；M、男性；HTN、高血圧；CVA、脳血管障害；h/o、～の歴史（history of）；ANA、抗核抗体；IgAN、IgA  腎症；UA、尿検査； T、移植腎臓：  SV-40、サルウイルス 40；RCC、腎細胞癌；HFpEF、駆出率が保持された心不全；DSA、ドナー特異的抗体；s/p、ステータス  ポスト；DDKT、故人腎移植；DGF、遅延移植機能；AFib、心房細動；
  HLPD、高脂血症。

さらに、我々は、腎臓病の証拠がある活動性 COVID-19 患者から採取した 8 つの生検で SARS-CoV-2 RNA の In situ ハイブリダイゼーションを行ったが、十分な陽性コントロールにもかかわらず、腎組織内でウイルス RNA を検出することができなかった。これは、SARS-CoV-2 RNA が剖検された 22 個の腎臓のうち 13 個の腎組織内で RT-PCR により検出されたという最近の研究とは対照的に見えるが、検出されたウイルス RNA レベルは非常に低く（細胞あたり 1 コピーという最低検出限界に近い）、潜在的に腎血管内のウイルス RNA を表している可能性があることに留意すべきである（12）。腎コンパートメントごとのマイクロダイセクションは 6 例しか行われておらず、そのうち糸球体コンパートメント内のウイルス RNA が陽性であったのは 3 例のみで、やはり血液中のウイルス粒子に起因する可能性がある。1 つの例では、空間分割 in situ ハイブリダイゼーションにより、尿細管上皮と糸球体内に SARS-CoV-2 の RNA が陽性であることが示されているが、これが何例あったのか、またこれが無傷のウイルス粒子に対応するものなのかどうかは明らかではない。

SARS-CoV-2 ウイルス粒子を模倣した丸い小胞の細胞内集団を生成できる天然の模倣物質の可能性は数多く挙げられるが、中でもエンドサイトーシス小胞や、エクソソームを含む微小胞体などのエンドソームコンパートメント成分が有力である。エンドサイトーシスでは、60～120 nm の小胞が形成されるが、これは SARS-CoV-2（60～140 nm）について記載されているサイズ範囲内である（2）。これらのエンドサイトーシス小胞は、さまざまなタンパク質でコーティングされている可能性があり、最も一般的なタンパク質の 1 つがクラスリンである(13)。これらの小胞の周囲に電子密度の高い領域が存在し、ウイルスのコロナのように見えるのは、コーティングタンパク質の存在が原因であると考えられる。クラスリンを介したエンドサイトーシスの存在は、近位尿細管細胞でよく知られている。ポドサイトもまた、クラスリンを介したエンドサイトーシスとクラスリンに依存しないエンドサイトーシスの両方に依存しており、インテグリンやリポタンパク質の取り込みを制御することで濾過バリアを維持している(14)。ポドサイトの発生時や損傷後には、ネフリンとポドシンのラフトを介したエンドサイトーシスのクラスリン非依存性経路が、スリットの横隔膜の時空間的な向きを適切にするために重要であることが示されている(14)。ネフリンとポドシンの輸送と分布における役割を考えると、濾過バリア機能の喪失やポドサイトの細胞骨格および基底膜のリモデリングを伴うタンパク尿状態では、エンドサイト小胞の形成が増加する可能性がある。実際、Farquahr ら(15)は、1950 年代に糸球体の超微細構造に関する先駆的な研究を行い、ネフローゼ症候群の小児において細胞質小胞の数が増加していることを報告している。さらに、ポドサイトによるアルブミンのエンドサイトーシスが、in vitro および in vivo で、プロマイシン誘発性ネフローゼ症候群のマウスモデルにおいて証明されており（16）、アルブミン尿症における細胞質小胞の数の増加に寄与している可能性がある。

タンパク尿は COVID-19 では一般的な所見であり、病気の経過中のどこかの時点で患者の最大 63%に見られると言われている(17)。さらに、COVID-19 患者における腎障害の発生は、院内死亡率の上昇と関連している(18)。しかし、これまでに報告された腎病理学的所見に焦点を当てた最大のシリーズでは、タンパク尿に関する具体的なデータはほとんど得られなかった(19)。近位尿細管細胞もまた、ろ過された高分子を再吸収するという機能を果たすために、エンドサイトプロセスに強く依存している。エンドサイトプロセスは、受容体を介したエンドサイトーシスと液相エンドサイトーシスの両方によって達成することができる(20)。

あるいは、ウイルス様封入体は、細胞表面に放出される前のエクソソームを含む微小胞体である可能性もある。エクソソームは、エンドソーム区画内で、微小胞体内の腔内小胞として形成され、最終的には細胞膜と融合して放出される(21)。ポドサイトを含め、尿路空間に接する腎臓のほぼすべての部位でエクソソームが形成される(22)。最近、アルブミンのトランスサイトーシスのモデルが提案された。アルブミンはまずポドサイトの毛細血管側でエンドサイトーシスされ、続いてポドサイトの先端膜を通って、尿中に検出されるエクソソームの中にエキソサイトーシスされる(16)。これらのエクソソームがポドサイト由来であることは、ポドカリキシンなどのポドサイト細胞体に典型的なタンパク質の存在によって確認されている（16）。このことからも、タンパク尿を呈する COVID-19 患者において、ポドサイト内の細胞質小胞の数が増加していることが考えられ、これらがビリオンであるとの誤った推測がなされる可能性がある。個々のエクソソームの大きさは様々であるが、一般的には 30～150nm であり(21)、SARS コロナウイルスで報告されている大きさの範囲内に収まっている(9)。実際、コロナウイルス粒子と正常な細胞成分が混同される可能性があることは、2003 年の SARS 発生の原因となった SARS-CoVについて、米国疾病対策予防センター（CDC）が行った詳細な超微細構造の研究で明らかになっている（9）。著者らは、臨床検体の場合、ウイルス抗原の免疫電子顕微鏡検査や超微細構造のウイルス RNA in situ  ハイブリダイゼーションによって、封入体のウイルス性を確認すべきであると提言している（9）。

この「ウイルス様粒子」の落とし穴についての認識は、1970 年代にさかのぼる。様々な種類の癌細胞や体液中に超微細なウイルス粒子を発見したとする研究が盛んに行われた後、食細胞液胞、微小胞状体、細胞外分解物などの正常な細胞成分がウイルス粒子であると誤認される可能性が強調されたのである(23)。このように、CDC（9）や以前の著者（15,23）の見解を支持し、免疫電子顕微鏡や in situ  ハイブリダイゼーションによって組織内にウイルスタンパク質や RNA が確認されない限り、超微細構造画像を SARS-CoV-2 の組織感染の証拠として使用することに注意を喚起したい。

情報開示

C. Larsenは、提出された研究以外では、研究実施中にNational Institutes of Healthから助成金を受けたことを報告している。残りの著者全員は何も公表することはない。

参考文献

1. Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, Si HR, Zhu Y, Li B, Huang CL, Chen HD, Chen J, Luo Y, Guo H, Jiang RD, Liu MQ, Chen Y, Shen XR, Wang X, Zheng XS, Zhao K, Chen QJ, Deng F, Liu LL, Yan B, Zhan FX, Wang YY, Xiao GF, Shi ZL: A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature 579: 270–273, 2020
2. Zhu N, Zhang D, Wang W, Li X, Yang B, Song J, Zhao X, Huang B, Shi W, Lu R, Niu P, Zhan F, Ma X, Wang D, Xu W, Wu G, Gao GF, Tan W; China Novel Coronavirus Investigating and Research Team: A novel coronavirus from patients with pneumonia inChina, 2019. N Engl J Med 382: 727–733, 2020
3. Zou X, Chen K, Zou J, Han P, Hao J, Han Z: Single-cell RNA-seqdata analysis on the receptor ACE2 expression reveals the potential risk of different human organs vulnerable to 2019-nCo Vinfection. Front Med 14: 185–192, 2020
4. Ye M, Wysocki J, William J, Soler MJ, Cokic I, Batlle D: Glomerular localization and expression of Angiotensin-converting enzyme 2 and Angiotensin-converting enzyme: Implications for albuminuria in diabetes. J Am Soc Nephrol 17: 3067–3075, 2006
5. Wang W, Xu Y, Gao R, Lu R, Han K, Wu G, Tan W: Detection of SARS-CoV-2 in different types of clinical specimens. JAMA 323: 1843–1844, 2020
6. LescureF-X, Bouadma L, Nguyen D, Parisey M, Wicky PH, Behillil S, Gaymard A, Bouscambert-Duchamp M, Donati F, Le Hingrat Q, Enouf V, Houhou-Fidouh N, Valette M, Mailles A, Lucet JC, Mentre F, Duval X, Descamps D, Malvy D, Timsit JF, Lina B, van-der-Werf S, Yazdanpanah Y: Clinical and virological data of the first cases of COVID-19 in Europe: A case series [published correction appears in Lancet Infect Dis 20: e148, 2020]. Lancet Infect Dis 20: 697–706, 2020
7. Wo¨lfel R, Corman VM, Guggemos W, Seilmaier M, Zange S, Mu¨ller MA, Niemeyer D, Jones TC, Vollmar P, Rothe C, Hoelscher M, Bleicker T, Bru¨nink S, Schneider J, Ehmann R, Zwirglmaier K, Drosten C, Wendtner C: Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature 581: 465–469, 2020
8. Huang C, Wang Y, Li X, Ren L, Zhao J, Hu Y, Zhang L, Fan G, Xu J, Gu X, Cheng Z, Yu T, Xia J, Wei Y, Wu W, Xie X, Yin W, Li H, Liu M, Xiao Y, Gao H, Guo L, Xie J, Wang G, Jiang R, Gao Z, Jin Q, Wang J, Cao B: Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China [published correction appears in Lancet 395: 496, 2020]. Lancet 395: 497–506, 2020
9. Goldsmith CS, Tatti KM, Ksiazek TG, Rollin PE, Comer JA, Lee WW, Rota PA, Bankamp B, Bellini WJ, Zaki SR: Ultrastructural characterization of SARS coronavirus. Emerg Infect Dis 10: 320–326, 2004
10. Larsen CP, Bourne TD, Wilson JD, Saqqa O, Sharshir MA: Collapsing glomerulopathy in a patient with coronavirus disease 2019 (COVID-19). Kidney Int Rep 5: 935–939, 2020
11. Peleg Y, Kudose S, D’Agati V, Siddall E, Ahmad S, Kisselev S, Gharavi A, Canetta P: Acute kidney injury due to collapsing glomerulopathy following COVID-19 infection. Kidney Int Rep 5: 940–945, 2020
12. Puelles VG, Lu¨tgehetmann M, Lindenmeyer MT, Sperhake JP, Wong MN, Allweiss L, Chilla S, Heinemann A, Wanner N, Liu S, Braun F, Lu S, Pfefferle S, Schro¨der AS, Edler C, Gross O, Glatzel M, Wichmann D, Wiech T, Kluge S, Pueschel K, Aepfelbacher M, Huber TB: Multiorgan and renal tropism of SARS-CoV-2 [published online ahead of print May 13, 2020]. N Engl J Med doi:10.1056/NEJMc2011400
13. Kaksonen M, Roux A: Mechanisms of clathrin-mediated endocytosis. Nat Rev Mol Cell Biol 19: 313–326, 2018
14. Inoue K, Ishibe S: Podocyte endocytosis in the regulation of the glomerular filtration barrier. Am J Physiol Renal Physiol 309: F398–F405, 2015
15. Farquhar MG, Vernier RL, Good RA: An electron microscope study of the glomerulus in nephrosis, glomerulonephritis, and lupus erythematosus. J Exp Med 106: 649–660, 1957
16. Castrop H, Schießl IM: Novel routes of albumin passage across the glomerular filtration barrier. Acta Physiol (Oxf) 219: 544–553, 2017
17. Naicker S, Yang CW, Hwang SJ, Liu BC, Chen JH, Jha V: The Novel Coronavirus 2019 epidemic and kidneys. Kidney Int 97: 824–828, 2020
18. Cheng Y, Luo R, Wang K, Zhang M, Wang Z, Dong L, Li J, Yao Y, Ge S, Xu G: Kidney disease is associated with in-hospital death of patients with COVID-19. Kidney Int 97: 829–838, 2020
19. Su H, Yang M, Wan C, Yi LX, Tang F, Zhu HY, Yi F, Yang HC, Fogo AB, Nie X, Zhang C: Renal histopathological analysis of 26 postmortem findings of patients with COVID-19 in China. Kidney
    Int 98: 219–227, 2020
20. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, Haenni D, Gassama A, Tokonami N, Ghazi S, Bugarski M, Devuyst O, Ziegler U, Hall AM: Combined structural and functional imaging of the kidney reveals major axial differences in proximal tubule endocytosis. J Am Soc Nephrol 29: 2696–2712, 2018
21. Karpman D, Sta˚hl AL, Arvidsson I: Extracellular vesicles in renal disease. Nat Rev Nephrol 13: 545–562, 2017
22. Pisitkun T, Shen RF, Knepper MA: Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 13368–13373, 2004
23. Dalton AJ: Microvesicles and vesicles of multivesicular bodies versus “virus-like” particles. J Natl Cancer Inst 54: 1137–1148, 1975

受付：2020年5月4日、受理 2020年6月25日